LongTaqDNAPolymerase

概述
    Long Taq DNA Polymerase是华因康Taq DNA Polymerase和一种具有3→5校对活性的耐热DNA聚合酶按照特定比例混合而成。该酶与普通的Taq DNA Polymerase相比，它具有保真性高、扩增效率高、高效扩增GC Rich的复杂片段（配合2×HYK GC Buffer，with 4mM MgSO₄）的优良性能。Long Taq DNA Polymerase扩增产物可用于TA克隆，如需提高克隆效率，建议先纯化PCR产物，加A后再进行TA克隆。
 
应用特点
    1.高效特异PCR扩增、Long Range PCR、TA克隆、GC Rich片段扩增、AT Rich片段扩增。   
    2.LongTaq DNA Polymerase的保真性是普通Taq DNA Polymerase的3倍以上。 
    3.病毒模板可扩增至30kb，人基因组可有效扩增17.6kb片段（beta globin）；配合2×HYK GC Buffer（with 4mM MgSO₄）可高效扩增GC Rich片段。
    4.扩增速率：1kb/min。

活性单位定义
     1单位（U）Long Taq DNA Polymerase活力定义为在72℃条件下，30min内，以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，催化掺入10nmol 脱氧核苷酸成为酸不溶性物质所需的酶量。
 
保存
     -20°C低温保存。
 
抑制和失活
     失活：酚/氯仿抽提。
 
保存缓冲液
     20mMTris-HCl(PH7.4 25℃)、100mMKCl、0.1mMEDTA、0.1%NP-40(v/v)、0.1% Tween-20 (v/v)、1mMDTT和50 %甘油（v/v）。
 
反应缓冲液
    （1）5×Long Taq Buffer（with 10mM MgSO₄）
         300mMTris-SO₄(PH7.4 25℃)、100mM(NH₄)₂SO₄、10mMMgSO₄、0.3%NP-40(v/v)、0.25%Tween-20  (v/v)T，Stabilizer。
    （2）2×HYK GCBuffer（with 4mM MgSO₄）
         120mMTris-SO₄(PH9.0 25℃)、40mM(NH₄)₂SO₄、4mMMgSO₄、0.15%NP-40(v/v)、0.12%Tween-20 (v/v)T，其他成分。
 
使用说明
    1.Long Range PCR（＞10kb）

 

组分	终浓度
ddH2O（nuclease-free）	变量
5×Long Taq Buffer（with10mM MgSO4）	1×
dNTP Mix	500µM each
Forward primer	0.4µM
Reverse primer	0.4µM
Template DNA	50pg~1µg
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl）	1.25U~2.5U
总体积	50µl

 

组分	终浓度
ddH2O（nuclease-free）	变量
2×HYK GC Buffer（with 4mM MgSO4）	1×
dNTP Mix	200µM each
Forward primer	0.2µM
Reverse primer	0.2µM
Template DNA	50pg~1µg
Long Taq DNA Polymerase（5U/μl）	1.25U~2.5U
总体积	50µl

注意事项：① 使用2×HYK GC Buffer（with 4mM MgSO₄）进行PCR扩增时，建议使用Tm值较高的引物；引物最好设计在30mer左右；
②  PCR的反应体系请在冰上配制，然后置于预热至变性温度下的PCR反应仪上进行PCR反应，可增强PCR扩增的特异性。
    一般情况下，若5×Long Taq Buffer（with10mM MgSO₄）扩增不成功，可尝试用2×HYK   GC Buffer（with 4mM MgSO₄）扩增。
质量控制   
    纯度检测：经SDS-PAGE检测纯度大于95%。
    核酸内切酶检测：10U Long Taq DNA Polymerase与500ng λDNA在1×Long Taq buffer中37℃共同孵育16h，0.8%琼脂糖电泳检测，DNA没有出现降解和被切断，表示通过该项检测。
    核酸外切酶检测：10U Long Taq DNA Polymerase与200ng 50 bp ssDNA在1×Long Taq buffer中37℃共同孵育16h，15%变性PAGE胶电泳检测，DNA没有出现降解，表示通过该项检测。
    大肠杆菌DNA污染检测：
     PCR 产物：544 bp
     Forward primer：5-GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3
     Reverse primer：5-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-3
     PCR程序：94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
     0.8%琼脂糖电泳检测没有544bp产物出现，表明通过该项检测。
    质粒污染检测：
     T7 Promoter Primer：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3
     T7 terminator Primer：5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3
     PCR程序：94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min.
     0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现，表明通过该项检测。
    支原体污染检测：
     PCR产物：717 bp
     GPO-1：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3
     MGSO：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3
     PCR程序：94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min.
     0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现，表明通过该项检测。