KlenowFragment

概述
    Klenow Fragment是大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段，具有5→3的DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶校正活性，但失去了5→3外切核酸酶活性。
 
应用
    1.DNA平端化，5’突出段补平。
    2.随机引物探针的合成。
    3.第二链cDNA合成。
    4.Sanger方法DNA测序。

来源
    从带有编码DNA聚合酶I基因的E.coli polA菌株中提取，并利用基因重组技术，使用E.coli表达和纯化Klenow Fragment。

活性单位定义
    在37°C条件下，30min内能使10 nmol 的dNTP掺入酸不溶性物所需要的酶量定义为1个活性单位。
 
贮存条件
    25mMTris-HCl (PH 7.4)，0.1mMEDTA，1mMDTT,  50%甘油, -20℃贮存。
 
10×反应缓冲液
    100mMTris-HCl（PH 7.9 25℃）, 500mMNaCl ,100mMMgCl2 , 10mMDTT。反应时需要加入dNTP(不随酶提供)。

热失活
    75°C20min。
 
活性抑制剂
    金属离子螯合剂，无机焦磷酸盐(PPi)，大剂量的无机磷酸盐(Pi)。
 
纯度
    考马斯蓝染色SDS-PAGE检测纯度大于90％，并无核酸内切酶、外切酶及RNase污染。
 
应用
    双链DNA 5’突出端（5’overhang）的补平
第一步：混合下面各种反应物：