Terminaldeoxynucleotidyltransferase
概述
TdT（末端脱氧核苷酸转移酶，Terminal deoxynucleotidyl transferase 是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3 羟基端，带有突出、凹陷或平滑末端的单、双链DNA分子均可作为TdT 的底物。
应用
1.催化DNA的3 末端添加同聚物。
2.利用修饰碱基（如ddNTP，DIG-dUTP）标记DNA 3 末端。
3.dUTP 缺口末端标记（细胞凋亡的原位检测）。
来源
大肠杆菌细胞，含有编码牛胸腺末端脱氧核苷酸转移酶的基因。
活性单位定义
一个单位是指在37℃、60min内将1nmol脱氧核糖核酸掺入多聚核苷酸片段（吸附在DE-81上）所需的酶量。
贮存条件
100 mMpotassium acetate (PH 6.8), 2 mM 2-mercaptoethanol, 0.01%(v/v)Triton X-100 and 50%(v/v) glycerol, -20°C贮存。
5×ReactionBuffer
1 Mpotassium cacodylate,125 mM Tris, 0.05% (v/v) Triton X-100, 5 mMCoCl2(PH 7.2 25°C)。
反应条件
1×ReactionBuffer，37℃温育。
活性抑制
抑制剂：金属螯合剂、铵、氯化物、碘化物和磷酸盐离子。
失活：加入EDTA，或70℃加热10min。
注意
由于含有CoCl2，TdT反应缓冲液不能与下游应用兼容，需采用柱离心法或苯酚/氯仿抽提及乙醇沉淀方法纯化反应混合物，除去CoCl2。
质量控制
1.双链内切脱氧核糖核酸酶检测：50μl反应体系中，1μl酶和1μg pUC57，37℃孵育4h，0.8%琼脂糖凝胶检测。结果显示无切口或线性DNA存在，表明该产品通过此项测试。
2.内切及外切脱氧核糖核酸酶活性检测：20μl反应体系中，包含200ng双链的寡核苷酸，1μl酶，37℃孵育4h，反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测并成像分析实验结果。结果显示寡核苷酸没有降解，表明该产品通过此项测试。
3.DNA 末端完整性和克隆效率污染活性的检测：将200ng pUC57酶切片段混合物（pUC57/HindⅢ，pUC57/PstⅠ，pUC57/SmaⅠ），1μl酶，37℃孵育40h，转化后进行蓝白斑筛选。白斑比例低于3%时，产品合格。