试剂盒介绍
大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA(Plasmid、Phage DNA),处于这种状态的细胞称作感受态细胞(Competent Cells)。
该感受态细胞用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA,CCC, GGA)对应的tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。使用pUC57 质粒检测,转化效率可达107。
使用方法
(1) 将100μl感受态细胞于冰上解冻。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。
(2) 取5μl连接产物加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
(3) 将管放入预加温到42℃的水浴中,热激90秒。快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却2~3分钟。该过程不要摇动离心管。
(4) 每管中加900μl LB(SOC)培养基(不含抗生素),37℃振荡培养1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。
(5) 室温4,000rpm离心5分钟,弃去900μl上清后,用剩余100μl培养基重悬细胞并涂布到LB琼脂平板表面。
(6) 将平板置于室温直至液体被吸收。
(7) 倒置平皿,于37℃培养,12~16小时后可出现菌落。
基因型
F-ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm lacY1 (DE3) pRARE (argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL) (CmR)
试剂盒内容
组 成 | KT1003-01 | KT1003-02 |
感受态细胞 | 10×100μl | 20×100μl |
pUC57 (0.1ng/μl) | 10μl | 10μl |
注意事项
(1) 感受态应保存在-70℃,不可多次冻融和放置时间过长,运输过程中应放入干冰中。
(2) 实验操作过程应严格无菌,防止其他DNA的污染,以免为以后的筛选、鉴定带来影响。