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用于在酵母中表达的载体

  • 进口
    IBA现供应两种带有Strep-tagÒ和瑞士Dualsystems Biotech AG(www.dualsystmes.com)的HA epitope-tag的酵母载体。

    特点:

    1、高水平、可诱导的表达

    2、无需加入用于诱导的试剂或改变培养基

    3、导受紧密调控使表达毒性蛋白质

    载体pKS1-ST和pKS2-ST组合了蛋白质表达的两个重要特点:

    1、诱导的ADH2启动子:ADH2启动子受培养基中葡萄糖缺失的诱导。在早期生长过程中,葡萄糖充裕,启动子无活性,因此防止对酵母生长的负效应。当细胞到达静止早期时,葡萄糖被培养基耗尽,ADH2启动子被诱导,产生大量蛋白质。

    2、anMX表达框:不象其他酵母表达载体,pKS-ST载体特有一个KanMX表达框,使得可以在丰富培养基中以G418筛选。丰富培养基如YPD的使用将显著增强细胞密度和蛋白质产量。

    比较所有Strep-tagÒ, 6´Histidine-tagdouble-tag载体 
















































































































































































































































































































































































































































































































    质粒

    Strep-tag

    6xHis

    -tag

    HA

    epitope-tag

    分泌

    Tag去除

    蛋白酶

    抗性

    目录号

    大肠杆菌载体:具有tet启动子用于胞质外周表达

    pASK-IBA2

    C-端

    -

    -

    Yes

    No

    -

    Amp

    2-1301-000

    pASK-IBA4

    N-端

    -

    -

    Yes

    No

    -

    Amp

    2-1303-000

    pASK-IBA6

    N-端

    -

    -

    Yes

    Yes

    factor Xa

    Amp

    2-1305-000

    pASK-IBA12

    N-端

    -

    -

    Yes

    Yes

    thrombin

    Amp

    2-1311-000

    pASK-IBA14

    N-端

    -

    -

    Yes

    Yes

    enterokinase

    Amp

    2-1313-000

    pASK-IBA32

    -

    C-端

    -

    Yes

    No

    -

    Amp

    2-1332-000

    pASK-IBA44

    N-端

    C-端

    -

    Yes

    No

    -

    Amp

    2-1344-000

    大肠杆菌载体:具有tet启动子用于细胞质表达

    pASK-IBA3plus

    C-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1402-000

    pASK-IBA5plus

    N-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1404-000

    pASK-IBA7plus

    N-端

    -

    -

    No

    Yes

    factor Xa

    Amp

    2-1406-000

    pASK-IBA13plus

    N-端

    -

    -

    No

    Yes

    thrombin

    Amp

    2-1412-000

    pASK-IBA15plus

    N-端

    -

    -

    No

    Yes

    enterokinase

    Amp

    2-1414-000

    pASK-IBA17plus

    N-端

    -

    -

    No

    Yes

    TEV protease

    Amp

    2-1416-000

    pASK-IBA33plus

    -

    C-端

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1433-000

    pASK-IBA35plus

    -

    N-端

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1435-000

    pASK-IBA37plus

    -

    N-端

    -

    No

    Yes

    factor Xa

    Amp

    2-1437-000

    pASK-IBA43plus

    C-端

    N-端

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1443-000

    pASK-IBA45plus

    N-端

    C-端

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1445-000

    pASK-IBA63a-plus

    C-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1463-100

    pASK-IBA63b-plus

    C-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1463-200

    pASK-IBA63c-plus

    C-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1463-300

    pASK-IBA65b-plus

    N-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1465-200

    大肠杆菌载体:具有tet启动子和氯霉素抗性(CAT

    pASK-IBA2C

    C-端

    -

    -

    Yes

    No

    -

    CAT

    2-1321-000

    pASK-IBA3C

    C-端

    -

    -

    No

    No

    -

    CAT

    2-1322-000

    pASK-IBA4C

    N-端

    -

    -

    Yes

    No

    -

    CAT

    2-1323-000

    pASK-IBA5C

    N-端

    -

    -

    No

    No

    -

    CAT

    2-1324-000

    pASK-IBA6C

    N-端

    -

    -

    Yes

    Yes

    factor Xa

    CAT

    2-1325-000

    pASK-IBA7C

    N-端

    -

    -

    No

    Yes

    factor Xa

    CAT

    2-1326-000

    大肠杆菌载体:具有T7启动子

    pPR-IBA1

    C-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1390-000

    pPR-IBA2

    N-端

    -

    -

    No

    No

    -

    Amp

    2-1391-000

    哺乳动物载体:具有人CMV启动子

    pEXPR-IBA3

    C-端

     

    -

    No

    No

    -

    Amp/Neo

    2-1903-000

    pEXPR-IBA5

    N-端

     

    -

    No

    No,

    -

    Amp/Neo

    2-1905-000

    pE, XPR,, , ,, -I, B, A7<, /DIV>

    N-端

     

    -

    No

    Yes

    factor Xa

    Amp/Neo

    2-1907-000

    pEXPR-IBA13

    N-端

     

    -

    No

    Yes

    thrombin

    Amp/Neo

    2-1913-000

    pEXPR-IBA15

    N-端

     

    -

    No

    Yes

    enterokinase

    Amp/Neo

    2-1915-000

    pEXPR-IBA17

    N-端

     

    -

    No

    Yes

    TEV protease

    Amp/Neo

    2-1917-000

    pEXPR-IBA42

    C-端

    N-端

    -

    Yes

    No

    -

    Amp/Neo

    2-1942-000

    pEXPR-IBA43

    C-端

    N-端

    -

    No

    No

    -

    Amp/Neo

    2-1943-000

    pEXPR-IBA44

    N-端

    C-端

    -

    Yes

    No

    -

    Amp/Neo

    2-1944-000

    pEXPR-IBA45

    N-端

    C-端

    -

    No

    No

    -

    Amp/Neo

    2-1945-000

    酵母载体:具有ADH2启动子

    pKS1-ST

    N-端

    -

    N-端

    No

    No

    -

    Amp/G418

    2-3801-000

    pKS2-ST

    N-端

    -

    N-端

    Yes

    No

    -

    Amp/G418

    2-3802-000



    每个载体的规格:5ug


























































    产品

    规格

    目录号

    测序引物

    pASK-IBA载体:上游测序引物

    1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-101

    pASK-IBA载体:下游测序引物

    1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-102

    pASK-IBA载体:上、下游测序引物

    1nmol each, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-104

    pPR-IBA载体:上游测序引物

    1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-111

    pPR-IBA载体:下游测序引物

    1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-112

    pPR-IBA载体:上、下游测序引物

    1nmol each, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-114

    pEXPR-IBA载体:上游测序引物

    1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-121

    pEXPR-IBA载体:下游测序引物

    1nmol, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-122

    pEXPR-IBA载体:上、下游测序引物

    1nmol each, 10pmol/ul, HPLC纯化

    5-0000-124

     

      除了表达载体,IBA还提供围绕Strep-tag用于蛋白质纯化、检测、分析(蛋白质固定)、蛋白质:蛋白质相互作用研究以及高通量纯化的完整的产品组合。

     















    The tag

    技术

    蛋白质

    仅8个氨基酸

    平衡的氨基酸组成 – 对蛋白质的结构和活性一般没有影响

    高选择性和易于控制的结合属性

    C-或N-末端融合

    无需去除

    有效和通用的表达载体,标准化的克隆策略

    生理条件下的亲和层析

    通过颜色改变可见柱再生和活性状态(见下)

    可获得超过99%的纯度

    Strep-tag适用于:

    金属蛋白

    膜蛋白

    具有多个亚单位的敏感蛋白质复合体

    以及其他任何蛋白质

     

     
















    结合:

    GFP Strep-tag 蛋白结合于Strep-Tactin

     

    洗脱:

    用脱硫生物素

     

    再生(颜色控制):

    开始去除脱硫生物素

     

    再生:

    脱硫生物素被完全除去

     

    再生:

    用平衡缓冲液快速再生

     

    纯化在E. coli 中过度表达的GFP-Strep-tag II 融合蛋白

    图片(从左至右):1、GFP-Strep-tag II融合蛋白特异结合在Strep-Tactin SepharoseÒ柱上,而非特异性蛋白质被少量生理性洗涤缓冲液迅速洗去。2、由于加入特异性竞争剂脱硫生物素,Strep-tag蛋白被洗脱。3-5、柱再生:脱硫生物素被黄色溶液HABA取代,后者一旦与Strep-Tactin复合即变为红色。HABA随后被洗涤缓冲液除去,柱子可被重新使用。 

    怎样获得优良无比的纯化因素

      Strep-tag® 纯化系统是基于Strep-tag II肽和特殊设计的Strep-Tactin(streptavidin的变体)之间高选择性和极易控制的相互作用而建立起来的蛋白纯化系统。Strep-tag IIStrep-Tactin的结合亲和力比对streptavidin高将近100。在亲和纯化过程中,附了tag的蛋白质结合在被固定了的Strep-Tactin上。生理缓冲液如PBS可与一系列添加剂一起用于该纯化过程。短暂的洗涤步骤之后,在同一缓冲液中加入脱硫生物素(2.5 mM)即可将纯化的重组蛋白温和地洗脱下来。脱硫生物素是一种便宜的、可逆结合的、稳定的生物素类似物,而生物素是streptavidin的天然配体。这种竞争性洗脱是赋予特异性的第二步,从而得到优良无比的纯化因素。该系统安全、易于使用;纯化柱再生和活性状态可以通过纯化柱上的颜色改变来观察到。

    Strep-tag融合蛋白可以经Western blots, ELISA, 电子或荧光显微镜进行方便的检测。有相应的Strep-Tactin酶共轭物和抗Strep-tag II的单克隆抗体供出售。

     

    Strep-tag®II对蛋白质的影响可以忽略

      此8个氨基酸的短肽tag由于具有化学平衡的氨基酸组成(WSHPQFEK),因此对重组蛋白的影响可以忽略不计。该tag可以被置于C-端或N-端。建议在蛋白和tag之间加入2个氨基酸的间隔以确保tag的可接近性。总的来说,该tag不干扰蛋白质的折叠或生物活性、不与重金属离子缓冲液杂质反应、无离子交换属性、不会诱导蛋白质聚集。因此无需去除该tag。

     

    Strep-Tactin®:长效的亲和柱

      Strep-Tactin是streptavidin的一种衍生物,是已知最稳定的蛋白质之一。Streptavidin对以8 M urea或guanidine, 0.5 M NaOH以及50 % formamide (t = 1 h; T = 37 °C)的处理保持稳定。蛋白酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和弹性蛋白酶等) 在1:50 w/w比例下,37 °C孵育2小时都无法切割 streptavidin。当SDS存在时,仅在温度高于60 °C时,streptavidin才开始降解成单体。经过测试,Strep-Tactin已经被证实具有上述作为长效亲和柱必备的卓越特性,可被重复使用3-5次。而且,Strep-Tactin的中性PI值使非特异性蛋白质或核酸的结合降到最低。

     

    Strep-Tactin树脂技术指标

     

      有5种版本Strep-Tactin树脂,区别在于其特性和应用。Strep-Tactin Sepharose®优先用于重力流层析;Strep-Tactin Superflow®和Strep-Tactin MacroPrep® 也可用于低压力或FPLC;Strep-Tactin POROS® (20和50)用于FPLC和HPLC层析。每个基质都会表现出不同的非特异性结合性质,当使用某种基质由于非特异性背景而无法获得满意结果时,建议换用其它的基质(亦请见Strep-Tactin Column Evaluation Sets)。此外Superflow尤其适用于增加的流速,也适用于大的蛋白质复合物的纯化。

      请注意,Strep-Tactin树脂被优化用于柱亲和层析,而不适用于批量纯化。批量纯化请使用IBA的MagStrep Strep-Tactin包被的磁珠。

    表1: 与Strep-tag/Strep-Tactin相互作用兼容的试剂












































































































































    试剂

    浓度

    Reduction Agents

    DTT

    50 mM

    β-mercaptoethanol

    50 mM

    Non-Ionic Detergents

    C8E4 Octyltetraoxyethylene

    最高0.88 %

    C10E5; Decylpentaoxyethylene

    0.12 %

    C10 E6

    0.03 %

    C12 E8

    0.005 %

    C12E9; Dodecyl nonaoxyethylene (Thesit)

    0.023 %

    DM; Decyl-β-D-maltoside

    0.35 %

    LM; N-dodecyl β-D-maltoside

    0.007 %

    NG; N-nonyl-β-D-glucopyranoside

    0.2 %

    OG; N-octyl-β-D-glucopyranoside

    2.34 %

    TX; Triton X-100

    2 %

    Tween 20

    2 %

    Ionic Detergents

    N-lauryl-sarcosine

    2 %

    8-HESO;N-octyl-2-hydroxy-ethylsulfoxide

    1,32 %

    SDS; Sodium-N-dodecyl sulfate

    0.1 %

    Zwitter-Ionic Detergents

    CHAPS

    0.1 %

    DDAO; N-decyl-N,N-dimethylamine-N-oxide

    0.034 %

    LDAO; N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide

    0.13 %

    其它

    Ammonium sulfate (NH4)2SO4

    2 M

    CaCl2

    最高1 M

    Ethanol

    10%

    EDTA

    50 mM

    Guanidine

    最高1 M

    Glycerol

    最高25 %

    Imidazole

    最高250 mM

    MgCl2

    1 M

    NaCl

    5 M

    Urea

    最高1 M

    注意:这些试剂在高达上述浓度下已成功用于纯化如GAPDH-Strep-tagÒ。未标注“最高”的试剂,也许可以使用更高浓度。由于结合依赖于Strep-tag在特殊蛋白质中的空间可及性,所给的浓度值对于其他蛋白质可能有偏差。